转化前要使土壤充分湿透

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年10月24日

  1 农杆菌感受态细胞的制备 挑取根癌农杆菌 GV3101 单菌落于 5 ml 含 100 ? g/ml 利福平 (Rifampicin) ,50 ? g/ml 卡那霉素(Kanmycin)和 50 ? g/ml 庆大霉素 (Genmycin)的 LB 液体培养基中,28℃振荡培养过夜;取过夜培养菌 液 500 ? l 接种于 50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中, 28℃振荡培 养 4-8 小时(OD600 为 0.5-0.8);冰浴 30 分钟,4,000 rpm,4℃离心 10 分钟,加入 10 ml 预冷的 20 mM CaCI2 悬浮农杆菌细胞,4000 rpm, 4℃离心 10 分钟;加入 2 ml 预冷的 20 mM CaCl2 悬浮细胞,冰浴, 分装成每管 100 ? l,液氮中速冻后,置-80℃保存备用。 2.质粒转化农杆菌 GV3101 将构建的带有目的基因的质粒 pCAMBIA-1304-plc 转化 (冻融法) 根 癌农杆菌 GV3101,步骤如下: 1) 从-80℃冰箱中取出 GV3101 感受 态细胞 (100 μl),置于冰上解 冻; 2) 加入 5 μl 含目的基因的质粒,轻轻混匀;冰水浴 5 min; 3) 液氮冷冻 8 min; 4) 37℃水浴热激 5 min; 5) 加入 900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于 28℃,160 r/min 振荡培养 3-5 h 复苏; 6) 复苏结束后于 4000 r/min 室温离心 5 min; 7) 吸去 800 μL 上清, 然后重悬菌体, 将菌体涂布于 LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上; 8) 28℃倒置培养 2 d 直至长出阳性菌落; 9) 挑取单克隆菌落,经 LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养,通过菌落 (液) PCR 验证,以确认是否成功转化。经验证转化成功的农杆菌经即 可用于后期拟南芥转化用。 (3 拟南芥的转化 在拟南芥抽苔 4-5 厘米时剪去主枝顶端,促进侧枝生长,约 4-5 天后进行转化,转化前要使土壤充分湿透,拟南芥苗要打药杀虫。 转化时将拟南芥的花序倒扣在盛有菌悬液的容器中,浸泡 10-30 秒,转化完毕后,将小花盆侧放于托盘中,盖上黑色塑料布,12-24 小时后揭开塑料布, 直立放置花盆, 按照正常的方法培育植株至结实, 收获成熟种子 将已经转化的 Tl 代成熟种子收取后,37℃烘干后准备阳性植株 的筛选。 由于表达载体带有除草剂抗性标记基因, 所以用 Basta(l:1(XX〕 ) 进行阳性植株的筛选。将 Tl 代种子在消毒之后均匀撒播在培养土的 表面,罩上盖子,当种子出苗后 3 天,打开盖子,在幼苗生长到 2 礴 片真叶后,喷洒 Basta 筛选阳性植株。) 3 拟南芥培养和转化 3.1 拟南芥培养 首先是拟南芥种子消毒, 将待播拟南芥种子 (每管 100 μ L) 分 装于 1.5 mLEppendorf 离心管中,每管加入 1 mL 70%乙醇,振荡器 上充分混匀,放置 2 min,微型离心机上离心后,用 1 mL 枪头吸去 乙醇,然后加入 1 mL 10%NaClO,振荡器上充分混匀,放置 15 min, 期间每隔 5 min 可以轻微振荡一次,可以提高消毒效果,离心后, 弃上清,用无菌水冲洗 5-6 次,并于超净台上吹干,即可播种。 将种子撒播于 MS 固体培养基上,也可用 45℃ MS 固体培养 基播种,方法是将种子和 MS 固体培养基充分混匀,倾倒于预先铺 一薄层 MS 固体培养基平皿中,轻微晃动平皿,使种子均匀平铺在 培养皿中。平皿用封口膜封好后在 4℃暗处理 3 d。 置于拟南芥培养室培养 ( 培养条件:湿度 60%;温度 22℃; 光周期 16 h 光/8 h 暗;光照强度 80-220 μ mol m-2 sec-1) 培养一 周左右,然后将其移栽至栽培介质 (草炭土:蛭石:珍珠岩按 5:4: 1 的比例掺匀),第一次移栽要用 0.1%“花无缺”复合肥溶液浇灌渗 透。 3.2 拟南芥转化 拟南芥转化采用 Clough 等发明的活体蘸花法 (Floral-dip)。具体 步骤如下: 1) 转化前菌体准备: 挑取平板上生长良好的阳性菌落,接种于 20 mL LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基中,28℃,250 r/min 振荡培养过夜。吸取 2 mL 培 养液,加入 50 mL LB/ (Gen + Kan+ Rif) 液体培养基,28℃,250 r/min 振荡培养至浓度为 OD600 = 0.5-0.8,然后 4500 r/min 离心收集菌体, 用 20 ml 拟南芥转化 Buffer (2.2 g/L MS 粉 + 5g/L 蔗糖 + 6-BA (1 mg/mL) +0.04%SILWET-77 (v/v),pH 5.8;蒸馏水配制,现配现用。) 悬 浮。 2) 转化: 选取生长一个月左右、生长状况良好的植株,在转化前一周掐除顶端 花序,使待转化植株产生更多的花蕾,在转化前一天浇足水。将拟南 芥花序浸入事先准备好的转化 Buffer 中,并轻微晃动,约 3-5 sec 取出, 轻轻弹去多余的液体, 用保鲜膜将整棵植株密封, 暗培养 16-24 h 后,揭去保鲜膜,给予正常光照和水分,直至种子成熟,收获。 3.3 转基因植株抗生素筛选 将所收获种子消毒 (条件同上) 后,播于 MS/hyg 固体培养基上。 暗培养 4℃冷处理 3 d,转移移至拟南芥培养室培养,并给予正常光 照和水分。约两周后,将绿色抗性幼苗移栽至栽培介质中继续生长。 按单株收获转基因株系并挂牌标识,待种子成熟后继续筛选,直至得 到纯合株系。

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