拟南芥线的基因克隆与初步功能分析doc

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年10月24日

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  拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆与初步功能分析拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆与初步功能分析单位代码学号分类号Q硕士学位论文拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆与初步功能分析MapbasedCloningandFunctionalAnalysisofTrueleavesetiolationMutantcflinArabidopsisthaliana专业名称:植物学研究方向:植物生理生化与分子生物学研究生姓名:白大勇导师姓名、职称:宋纯鹏教授完成日期:二零一三年五月MapbasedCloningandFunctionalAnalysisofTrueleavesetiolationMutantcflinArabidopsisthalianaADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByBaiDayongSupervisor:ProfSongChunpengDate:May,摘要叶绿体是高等植物进行光合作用的场所,组成高等植物叶绿体的蛋白质中,仅有多种是由叶绿体基因组编码,绝大多数为细胞核基因编码,在细胞质中翻译后转运到叶绿体。因此,叶绿体的发育依赖于细胞核基因和叶绿体基因的协同表达。然而由于叶绿体信号转导网络异常庞杂,我们对其分子机制依然知之甚少,其中仍然有诸多问题值得我们关注。因此,研究叶绿体的发育和调节机制势在必行。在本研究中,我们以拟南芥野生型Col为研究材料资源,用化学诱变剂甲基磺酸乙酯ethylmethylsulfonate,EMS处理野生型Col种子,构建拟南芥突变体库。通过叶绿素荧光成像技术筛选并分离得到一株叶绿素荧光强度较低的突变体cflchlorophyllfluorescencelower。进一步观察发现,突变体cfl的真叶有白色坏死斑点,叶片发育畸形,叶边缘缺刻严重,叶片发育不对称,生长缓慢,植株矮小,结实率低等表型。生理指标测量结果显示,白斑叶片叶绿素含量比野生型显著降低,电导率显著升高。叶片切片结果表明,突变体cfl的叶片中的叶绿体发育不完整,表现为基粒基质类囊体等结构缺失。遗传分析表明该表型是单基因隐性突变导致的。我们构建cfl和Landsberg杂交的F代群体图位克隆分析样本库,并利用图位克隆技术将该突变基因最终定位在MWDBACBacteriaArtificialChromosome上,通过测序分析和结果比对,找到突变基因CFL,该基因的第处一个碱基由G突变成A,对应编码的氨基酸由甘氨酸变成了丝氨酸。CFL的表达结构由个外显子和两个内含子构成,编码一个功能未知蛋白,为了进一步研究CFL在拟南芥发育中的功能,构建了回补、超表达和瞬时转化等载体。通过检验幼苗不同发育阶段叶绿体合成相关基因的表达情况,发现这些基因表达量都出现了不同程度的下调。综上研究数据表明,CFL是影响拟南芥发育的一个重要成员,该突变体的获得为我们进一步理解该基因功能和叶绿体的发育机制提供了理想的材料。关键词:叶绿体,叶绿素荧光成像,白斑突变体cfl,图位克隆,功能分析IIIABSTRACTInhigherplants,chloroplastistheplacewherephotosynthesistakesplaceThechloroplastgenomesofhigherplantstypicallyencodeonlyaboutgenes,andthemajorityofthechloroplastproteinsthathavefunctionsinthechloroplastareencodedbynucleargenes,translatedinthecytosolandsubsequentlyimportedintothechloroplastThus,thedevelopmentoffunctionalchloroplastsisdependentonthecoordinatedexpressionofnuclearandchloroplastgenesStudiesintotheprocessesofbiogenesisanddevelopmentofchloroplastshaveshownhowcomplexthechloroplastsignalnetisduringplantdevelopmentHowever,weknowlittleaboutitsdevelopmentmolecularmechanismThus,itisnecessarytounderstandtheregulationandmechanismofchloroplastdevelopmentInthisresearch,ArabidopsisthalianaecotypeColumbiawasusedandamutantlibrarywasestablishedbytreatingArabidopsisColumbiaseedswithchemicalmutagenesisagentsulfonicacidethylesterEMSWeusedchlorophyllfluorescenceimagingtoscreenandseparatealowerchlorophyllfluorescencevaluemutantwhencomparedwithwildtypeplant,wetermedthismutantcflchlorophyllfluorescencelowerFurtherstudyshowedthatthetrueleavesofcflweredeformed,itstrueleaveswerewhitevariegated,theleafmarginofthemutantweremoreserratedandasymmetricalcflgrewmoreslowlythanwildtypeplants,theproductionofthemutantandplantheightwerelowerthanwildtypePhysiologicalindexesmeasuredresultsshowedthatchlorophyllcontentinwhitevariegatedtrueleavesdecreasedsignificantlyandtheconductivityincreasedsignificantlywhencomparedwithwildtypeBiopsyresultsshowedthatchloroplastsstructureincflwhitevariegatedleaveswasincompletethatexhibitednogranaandstromathylakoidGeneticanalysisshowedthatvariegationphenotypeincflwasduetoasinglerecessivegenemutationWecrossedcflandLandsbergerectatoconstructacollectionofFwhichwereusedtomapthemutantgeneThemutantgenefinallywasresidedonBACBacteriaArtificialChromosomeMWDthroughmapbasedcloningThenwegotthemutantgeneCFLbygenesequencing,foundoneofitsbasesGchangedintoAatitssitebyblastingwiththesequenceprovidedinTheArabidopsisInformationResourceAndthematchedaminoacidchangedintoSerAGTfromGlyGGTGenomestructureofCFLconsistsofthreeextronsandtwointrons,encodinganunknownproteinTofurtherexaminethefunctionofCFLinArabidopsisdevelopment,weconstructedallkindsofvectorssuchIIIascomplementationvector,overexpressingvector,andtransientexpressionvectoretcWeexaminedtheexpressionprofilesofchloroplastphotosyntheticmarkergenesindifferentdevelopmentstagesbyRTPCR,andtheresultindicatedthattheexpressionofchloroplastphotosyntheticgenesweredownregulatedTakentogether,thesedataindicatedthatCFLwasanewplayerinchloroplastdevelopment,andthegainofthismutantprovideusanidealmaterialtoconductfurtherresearchonthefunctionofthisgeneandthedevelopmentmechanismofchloroplastKEYWORDS:Chloroplast,Chlorophyllfluorescenceimage,Variegationmutantcfl,Mapbasedcloning,FunctionanalysisIV缩写词英文缩写英文全称中文名称ABAAbscisicacid脱落酸ALAAminolevulinicacid氨基酮戊酸HOHydrogenperoxide过氧化氢DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯UVBUltravioletraysB紫外线BPBGPorphobilinogen单卟啉胆色素原ChlChlorophyll叶绿素EMSEthylmethanesulphonate甲基磺酸乙酯BACBacteriaartificialchromosome细菌人工染色体GSHReducedglutathione还原性谷胱甘肽PSIIPhotosystemII光系统II脱植基叶绿素ChlideChlorophyllideSDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠ProtoProtoporphyrin原卟啉TAETrisacetateelectrophoresisTris乙酸电泳缓冲液GluTRGlutamyltRNAreductase谷酰基tRNA转移酶PPFDPhotosyntheticphotonfluxdensity光合作用光子流量密度PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应NPQNonphotochemicalquenching非光化学淬灭CDSCodingDNAsequence编码区序列DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNARibonucliecacid核糖核酸CAOChlorophyllideaoxygenase脱植基叶绿素a加氧酶ctDNAChloroplastDNA叶绿体DNALHCLightharvestingchlorophyllprotein捕光色素蛋白脱镁叶绿酸盐水解酶PPHPheophorbidehydrolasePchlideProtochlorophyllide原叶绿素酸酯GFPGreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白HmbHydroxymethylbilane羟甲基胆色素原VUroUroporphyrinogen尿卟啉原NCCNonfluorescentchlorophyllcatabolite非荧光叶绿素代谢HemeHeme亚铁血红素PLBProlamellarbody原片层体PTprothylakoids原类囊体TICTransloconatinnerenvelopeofchloroplast叶绿体外膜易位子TOCTransloconatouterenvelopeofchloroplast叶绿体内膜易位子NEPNuclearencodedplastidRNApolymerase细胞核编码的质体RNA聚合酶PEPPlastidencodedplastidRNApolymerase叶绿体编码的质体RNA聚合酶PORprotochlorophyllideoxidoreductase原叶绿素酸酯氧化还原酶MCSMetalchelatingsubstance金属螯合物脱镁叶绿酸a加氧酶PAOPheideaoxygenaseRCCRRedchlorophyllcatabolitereductase红色叶绿素代谢产物还原酶VI目录摘要ABSTRACT缩写词V目录VII前言叶绿体发育研究进展叶绿体发育基因表达调控网络环境因子调控叶绿体发育叶绿素Chlorophyll,ChlChl的生物合成Chl的分解代谢光系统PSPS结构和功能PS的组装叶绿素荧光在叶绿体发育研究中的运用叶绿素荧光动力学参数叶绿素荧光动力学参数生物学意义叶绿素荧光在实践中的应用立题依据材料与方法常用仪器实验材料、载体和菌株材料质粒载体与菌株实验药品和试剂常用培养基及溶液的配制常用培养基的配制VII常用溶液的配制蛋白表达溶液拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达溶液常用抗生素的配制蛋白质提取液的配制实验方法拟南芥的栽培叶绿素含量的测定电导率的测定拟南芥基因组DNA的提取拟南芥的杂交图位克隆Trizol法提取拟南芥总RNA琼脂糖凝胶回收DNA质粒DNA的提取大肠杆菌感受态细胞的制备质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞重组质粒的鉴定农杆菌感受态细胞的制备重组质粒DNA转化农杆菌感受态细胞PEG介导拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达方法共聚焦显微镜观察GFP与叶绿体自发荧光共定位蛋白原核表达与小量提取与鉴定植物蛋白的提取和电泳检测载体构建结果与分析突变体的获得突变体cfl的发育表型突变体cfl与野生型Col中叶绿素含量的测定VIII突变体cfl与野生型Col中电导率的测定叶绿体显微结构切片分析参与叶绿体合成的相关基因的表达分析cfl植株的萌发实验突变体的遗传学分析突变体的图位克隆图位克隆材料的获得突变基因粗定位结果突变基因细定位结果突变基因测序结果突变基因半定量表达分析Salkline突变体表型分析回补载体的构建及回补植株的筛选回补载体CFL::pCAMBIA的构建农杆菌浸染法转化拟南芥回补植株的筛选CFL::psuper超表达载体的构建Salkline植株的萌发实验CFL::GFP载体的构建CFL::pHBTGFPNOS载体的构建及原生质体转化CFL::pEGADGFP稳定表达载体的构建pCFL::pCAMBIAGUS载体的构建CFL蛋白原核表达载体的构建讨论结论参考文献致谢附录:载体图谱IXX前言前言叶绿体是高等植物进行光合作用的重要场所,叶绿体发育的异常将直接影响绿色植物的形态建成。叶绿体是半自主性细胞器,自身含有特定的基因组ctDNA,还有RNAmRNA、tRNA、rRNA、核糖体、氨基酸活化酶等,具独立进行转录和翻译的功能。目前已知有多种特有的蛋白质是在叶绿体内合成的,但参与组装成叶绿体的蛋白质有上千种之多,显而易见,叶绿体绝大多数蛋白质由细胞核基因编码的,然后转移到叶绿体内,与叶绿体编码的蛋白协同作用。细胞核与发育成熟的叶绿体之间存在着密切的、精确的、严格调控的协调机制。随着拟南芥基因组测序的完成以及相关生物信息学软件如ChloroP和LumenP的开发,推测大约有个核基因组编码叶绿体蛋白质,根据TAIR数据库相关的注释分析发现,大概还有的叶绿体蛋白质功能尚不清楚,所以,叶绿体的研究仍是当前生物科学研究的重要方向之一。叶绿体发育研究进展叶绿体从原生质体,经前质体到最终的成熟是一个不断分化的过程。绿色植物的子叶、真叶、茎、花和果实中,随不同物种和不同发育阶段都有叶绿体的存在。子叶和真叶中叶绿体的发育过程是不同的,所以会有子叶正常而真叶叶色异常的突变体variegatedvar和immutans突变体以及子叶异常而真叶正常的突变体snowycotyledonsco被分离。叶绿体的发育是一个高度复杂的,受到严格调控的过程。叶绿体发育除了需要核基因和质基因的协调表达,还需要基因的选择性转录,转录后mRNA的编辑成熟mRNA的正确翻译,翻译后蛋白质的修饰、折叠和叶绿体蛋白的正确组装等。在叶绿体的整个生长发育过程中,任何一个环节出现错误都会导致叶绿体缺陷。此外,植物生长环境发生改变也会影响叶绿体发育。生长环境为叶绿体形成和发育的外界因子,其中光和温度是叶绿体生长发育最重要影响因素。在基础研究中,叶绿体相关突变体是进行植物光形态建成、光合作用等生理过程研究的理想材料,同时也用于分析鉴定相关植物基因的功能,了解基因之间相互作用。迄今已从拟南芥、烟草等植物中分离出许多叶绿体发育突变体,这些突变体中叶绿体发育在不同阶段受到严重阻碍。拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆及初步功能分析图:环境因子、细胞内因子和发育进程对叶绿体生成和发育的影响Figure:Modelofenvironmental,cellular,andtemporalfactorsthatinfluencechloroplastbiogenesisanddevelopmentinseedlings叶绿体发育基因表达调控网络叶绿体蛋白质的绝大多数是由细胞核基因编码的,仅有一小部分约由叶绿体基因组编码。所以核基因组与质体基因组之间协调表达对于正确的叶绿体生物合成和维持是非常重要的。一方面,质体的发育主要是由细胞核基因控制,另一方面,发育停滞或损伤的质体可以通过反馈信号路径调控核基因的表达。细胞核基因的转录光照条件下,约有的核基因转录发生改变。这些表达量明显上调的基因大都编码叶绿体定位蛋白。最初的光受体是光敏色素,比如phyA和phyB。光敏色素互作因子PIFsphytochromeinteractingfactors是参与光调节的转录的转录因子。光照条件下,phyB进入细胞核与PIF结合,引发光合磷酸化和阻扰phyB的降解。黑暗条件下,PIF负调控编码叶绿素合成中关键性调节酶HEMA和GUN的表达,同时也负调控PS复合物编码基因LHCA和PsaE。PIF和PIF的缺失会导致叶绿体发育延迟。除了PIFs,叶绿体发育还需要其它的转录因子,比如GoldenlikeproteinsGLKs。拟南芥中,缺失GLK转录因子将导致植株失色,叶片呈现白化表型。叶绿体蛋白的输入与加工近年来,细胞核基因编码的蛋白质是如何通过叶绿体的外膜和内膜进入叶绿体的这一问题的研究取得了相当大的成果。叶绿体定位的大部分蛋白质是通过位于叶绿体外膜前言上的易位子TOC和位于叶绿体内膜上的易位子TIC进入原质体的,其他的小部分叶绿体定位蛋白是通过内质网进入。相关突变体研究表明,外膜上的主要复合物TOC被敲除,会导致叶绿体合成急剧减少。进入叶绿体的蛋白质在位于基质中肽酶和相关热激蛋白作用下,去除N端的叶绿体定位信号肽。叶绿体内也有一套定位系统将进入叶绿体的蛋白选择性的整合到类囊体膜上和或类囊体腔中。蛋白质可以自发的整合到类囊体膜上,也可以像捕光色素结合蛋白一样通过叶绿体信号识别颗粒途径进行整合。ALBINO蛋白就是通过信号识别机制进行整合的,该蛋白功能的缺失会导致幼苗白化。蛋白进入类囊体腔有两条路径,一条是ATP依赖的信号识别途径,另一条是pH依赖的双精氨酸转运途径。这两种途径相关突变体都会导致幼苗致死或类囊体形成受阻。PISP,一个类囊体腔蛋白水解酶,参与类囊体定位蛋白PsbO和PsbP信号肽的去除。叶绿体基因的转录和翻译叶绿体基因的转录、RNA的加工、蛋白质的翻译和修饰对叶绿体的形成和发育有重要的影响。叶绿体基因至少含有种类型的启动子,由种或种以上RNA聚合酶催化转录。高等植物中,一种是叶绿体编码的RNA聚合酶,称为PEP聚合酶,主要是在叶绿体中起作用,负责与光合作用相关基因的转录另一种是核基因编码的RNA聚合酶,称为NEP聚合酶,主要负责持家基因如rRNA基因、tRNA基因、PEP基因等的转录。质体发育早期NEP较活跃,在光诱导的叶绿体成熟过程中,NEP活性受到抑制,PEP活性逐渐升高。质体RNA聚合酶因子sigmasig作为叶绿体基因的转录因、子,sig和sig的缺失导致叶绿体发育受阻。细胞核基因编码的质体RNA聚合酶也对叶绿体发育影响很大,如ropT。虽然叶绿体基因组仅编码种左右的蛋白质,但是任何一个基因的突变都将影响到叶绿体基因的转录和转录后RNA的编辑加工,最终导致光合作用功能受阻。近来,一大类核基因编码的PPRpentatricopeptiderepeats蛋白家族被证明对叶绿体RNA的加工、剪切、编辑、稳定和翻译等过程十分重要。很多PPRs突变体对植物都是致死的,,,每一个PPR蛋白的功能都是特异的。编辑成熟的叶绿体mRNA通过叶绿体内核糖体复合物翻译成蛋白质,因此,叶绿体内核糖体复合物重要组分的缺失会导致胚胎致死现象。因为编码核糖体复合物的基因的点突变造成叶色失绿变浅的突变体很多,如,sco和virescentOsvir。拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆及初步功能分析叶绿体蛋白质的折叠和降解叶绿体蛋白质是在分子伴侣如HSP、Cpn等调节下正确折叠加工的,hsp的突变会导致植株子叶斑点化现象。蛋白质二硫键异构酶也是蛋白质正确折叠所必不可少的,编码蛋白质二硫键异构酶基因scocyo的缺失导致子叶生长受限,叶色呈白绿,色。此外,叶绿体蛋白翻译和降解的速度对叶绿体发育也十分重要。金属蛋白酶家族FtsH突变体var,由于PSIID蛋白降解能力减弱导致真叶出现白色斑点化表型而子叶,却能正常生长,该表型可通过减弱该蛋白的翻译得到拯救。多亚基蛋白酶复合体ClpPR在叶绿体蛋白降解中处于中心地位,ClpP的缺失将导致胚胎和幼苗的致死。图:叶绿体合成和发育过程Figure:Processesrequiredforchloroplastbiogenesisanddevelopment类囊体的构成和相关色素的生物合成类囊体主要由内质网和叶绿体内产生的单半乳糖二酰基丙三醇和双半乳糖二酰基丙三醇构成。叶绿体脂质和蛋白质的合成和组装机制已经被阐明。很多影响类囊体形成的突变体相继被发现,虽然这些蛋白不是类囊体的直接的功能蛋白,它们却是类囊体复合物的重要的结构蛋白。在类囊体形成过程中,光合反应复合体也随着色素结合蛋白CABlightharvestingchlorophyllbinding和色素的协同输入而形成。在叶绿体发育过程中,类胡萝卜素和叶绿素对光合复合体的组装和光保护起十分重要的作用,因此,类胡萝卜素和叶绿素的生前言物合成被紧密的调控。可以通过识别非甲羟戊酸C甲基D赤藓糖醇磷酸MEP途径中相关酶的突变来筛选叶绿体发育相关突变体。叶绿体合成基因clb和clb,就是,通过这种方法发现的。环境因子调控叶绿体发育质基因和核基因表达调控是调控叶绿体发育的主要因素,除此以外,环境因子,细胞间作用和短暂的其他作用也是影响叶绿体生长发育的重要因素。光照与叶绿体发育在影响叶绿体发育的诸多环境影响因子中,光照对叶绿体的正常发育的影响是极其重要。高等植物的叶绿体由前质体发育而来。在无光照条件下前质体分化成白色体。白色体内具有典型的晶格样膜状原片层体,该片层体含有叶绿素和原叶绿素酸酯的前体、原叶绿素酸酯氧化还原酶protochlorophyllideoxidoreductasePOR、NADPH、油脂和一些蛋白质等。光照条件下,POR催化原叶绿素酸酯转变为叶绿素a。光照在光形态建成中通过控制基因转录,叶绿素合成和蛋白质降解起作用。突变体constitutivephotomorphogeniccopdeetiolatedfusca在黑暗条件下光形态建成的抑制作用解除,使萎黄的幼苗中叶绿体的合成起始和参与蛋白质泛素依赖途径的胞质信号小体COP形成。COP是一个受隐花色素调节的蓝光受体,使信号小体失活从而抑制参与光信号的转录因子蛋白的泛素化降解。拟南芥中共有五种光敏色素,分别由phyA、phyB、phyC、,phyD和phyE编码。在幼苗早期形态建成起作用的主要是phyA、phyB。图:光形态建成过程中光信号机制简图Figure:Asimplifiedmodeloflightsignallingduringphotomorphogenesis拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆及初步功能分析温度与叶绿体发育温度主要通过影响酶的活性而影响叶绿素的合成、光合复合体蛋白合成和转运以及其他与叶绿体生长发育相关活动的调控。水稻在生长h,叶绿体内的基粒解垛叠,基质中出现许多松散的膜结构,PS活性降低。低温条件下叶绿体膜的流动性降低,CP化合物被分解,基粒变小并有破坏,PS和PS都有不同程度的损伤。升高温度会导致某些叶绿体RNA编辑效率下降,如,将玉米从转移到,其叶绿体rps和rps的编辑效率从大约降到约。矿质元素与叶绿体发育矿质元素也是叶绿体的生长及发育的基础。植物中镁Mg是叶绿素的组成物质铁Fe是原叶绿素酸酯形成的必需因子铜Cu、锌Zn则是某些叶绿素合成酶的活化剂锰Mn是光合放氧复合体的关键元素。此外,CO浓度、水分、激素等也同样可以影响植物叶绿体生长和发育。叶绿素Chlorophyll,Chl叶绿素是叶绿体内参与光合作用的重要色素,在光合作用的能量捕获和传递中起着重要作用。叶绿素的合成需要光照诱导,没有叶绿素合成情况下,叶绿体光合系统无法正确组装。参与植物Chl合成、分解代谢及信号调控的基因数目众多,从谷氨酰tRNAGlutRNA开始到Chlb的合成结束为止一共包括步,共由多个基因编码的种酶催化完成。该合成途径中任何一个环节发生突变都可能影响Chl的合成,从而表现为各种叶色异常表型甚至导致植株死亡。目前,Chl突变体己广泛应用于基础研究和生产实践。在过去的几十年里,这些色素生物合成酶的基因相继被成功克隆,它们响应光和其它环境和发育影响因素的表达情况也得到一定的研究。Chl的生物合成叶绿素的生物合成可概要地分为四个阶段。第一阶段是从谷氨酸开始,通过谷酰基转移核糖核酸还原酶GluTR和谷氨酸盐半缩醛转氨酶GSAAT的激活,由参与蛋白质合成的谷酰基转移核糖核酸glutamyltRNAglu合成氨基酮戊酸ALA。两分子ALA合成含吡咯环胆色素原porphobilinogen,PBG。第二阶段,个PBG分子在胆色素原脱氨酶催化下线性聚合行成原卟啉Protoporphyrin,Proto。原卟啉是形成叶绿前言素和亚铁血红素的分水岭。如果与铁结合,就生成亚铁血红素,如果导入镁原子,则形成Mg原卟啉。后者E环环化,D环还原,就形成单乙烯基原叶绿素酯aPchlidea。在光照下和NADPH存在下,原叶绿素酯氧化还原酶催化后者化合物就进入第三阶段,形成叶绿素酯aChlidea。第四阶段是植醇尾巴与D环的丙酸酯化,就形成叶绿素aChl,a。植醇由香叶基香叶基焦磷酸GGPP提供,在白色体中,GGPP由异戊烯基焦磷酸通过非甲羟戊酸C赤藓糖醇磷酸即MEP途径合成。叶绿素bChlb由叶绿素aChla氧化形成的。一部分Chla在叶绿素a加氧酶CAO的作用下转变为Chlb。Chlb在Chlb还原酶和羟甲基Chla还原酶作用下,可逆的生成Chla。Chla和Chlb之间的相互”转变称为“叶绿素循环。图:植物Chl的生物合成途径Figure:CurrentmodelsofregulationmechanismsofChlmetabolismOnlyrepresentativeintermediatesandenzymesareshownTheregulatorygenes,whichareregulatedbylightandcircadianrhythm,arelabeledwithiconsof“sun”and“clock”Genes,whichshowgradualinductionbylight,arelabeledwith“palersun”icons拟南芥真叶白化突变体cfl的基因克隆及初步功能分析Chl的分解代谢在正常生长发育的植物中,大部分Chl存在于叶片的蛋白质复合体中,而以自由形式存在的Chl会对细胞造成光氧化损伤。为了避免自由态Chl及其有色代谢产物对细胞造成光氧化损伤,植物细胞必须快速降解这些物质。Chl的分解代谢反应分为两个阶段。首先,Chl被叶绿素酶Chlorophyllase,CLH催化脱去植醇基形成Chlide,然后,由一个金属螯合物Metalchelatingsubstance,MCS通过非酶学过程去除镁离子形成脱镁叶绿酸apheophorbidea,Pheidea,Pheidea经过脱镁叶绿酸a加氧酶Pheideaoxygenase,PAO和红色叶绿素代谢产物还原酶Redchlorophyllcatabolitereductase,RCCR催化的两步反应转化成pFCC,最后pFCC经过几次修饰之后运输至液泡中。第二个阶段,经过修饰的pFCC在液泡中发生非酶学异构形成最终的非荧光叶绿素代谢产物NonfluorescentChlorophyllCatabolites,NCCs,这是一个由酸性液泡的pH所催化的物种特异性修,,饰过程,最后转化形成单吡咯降解产物。图:植物叶绿素降解途径Figure:Thepathwayofchlorophyllcatabolism注:A,B表示从叶绿素a到脱镁叶绿素酸a两个可能的叶绿素降解途径,A:依赖于叶绿素酶B:依赖于脱镁叶绿素酶。前言光系统PS高等植物中叶绿体被称作叶肉细胞中的“能量转换站”,光能向化学能的转化是在该细胞器类囊体膜上进行的。类囊体膜上含有由多种亚基、多种成分组成的蛋白复合体,其中主要有光系统PS、光系统PS、Cytbf复合体和ATP酶复合体ATPase。蛋白复合体在类囊体上的分布非均匀而且具有流动性,PS主要存在于基粒片层的垛叠区,PS与ATPase存在于基质片层与基粒片层的非堆叠区,Cytbf复合体则分布较均匀。PS和PS由光合色素和叶绿体结构蛋白组装而成,在光刺激下,驱动电子从水传递到质体醌伴随着氧气的释放,产生能量ATP,是蓝细菌和叶绿体类囊体膜上重要的色素蛋白复合体。整个光反应中,电子起始于PS驱动的水的氧化光解,释放出供包括人类在内的非光合有机体的呼吸。PS结构和功能高等植物中,PS由多个亚单位组成,包含膜整合蛋白和膜外在相关蛋白。光系统反应中心复合物由D和D蛋白,细胞色素b的a亚基、b亚基和具有催化原初电子分离并参与随后的电子传递功能的Psb蛋白构成。光系统核心复合物也包含分子量为KD的氧还蛋白:光捕获色素叶绿素a结合蛋白CP、CP和一系列低分子量蛋白。CP和CP位于光系统反应中心复合物的对面与光系统反应中心复合物紧密协同作用。类囊体膜上的功能型光系统由光系统核心复合物和相关捕光复合体lightharvestingcomplexLHC组成。在PSLHC超复合体,Lhcb,和Lhbc锚定在PS核心二聚体构成LHC。其它次要的天线色素复合物如CP,CP和CP可能作为联系LHC和PS的连接蛋白。PS的组装PS的结构的复杂,其组装过程是多步骤的,而PS合成的起始步骤是PS反应中心复合物的合成。在此过程中,D蛋白整合到由D,细胞色素b和Psb构成的前体复合物中,CP直接与PS反应中心复合物协同组装。D,D和CP表现出协同性积累。CP是光系统的动态组分,它独立合成并通过持续性的分解和重新缔合循环。低分子量蛋白的向PS整合发生在PS组装的各个阶

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